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    cDNA文庫構建的實驗操作步驟
    
            
    
              發(fā)布日期：
              2021-10-15
            
    
            
    
              瀏覽人氣：
              2016
            
    
          
    
          
    
             　　cDNA文庫構建在研究具體某類特定細胞中基因組的表達狀態(tài)及表達基因的功能鑒定方便具有特殊的優(yōu)勢，從而使它在個體發(fā)育、細Chemicalbook胞分化、細胞周期調控、細胞衰老和死亡調控等生命現(xiàn)象的研究中具有更為廣泛的應用價值，是研究工作中最常使用到的基因文庫。
    　　
    　　cDNA文庫構建可以：
    　?。?）用于分離全長基因進而開展基因功能研究；
    　?。?）篩選目的基因并直接用于表達；
    　?。?）提供構建分子標記連鎖圖譜的所用探針。
    　　
    　　RNA的提取(例如異硫氰酸胍法，鹽酸胍—有機溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據(jù)不同的樣品而定)Chemicalbook，要構建一個高質量的cDNA文庫，獲得高質量的mRNA是至關重要的，所以處理mRNA樣品時必須仔細小心。
    　　
    　　實驗操作步驟：
    　　1.酚-氯仿對細胞裂解液進行處理，加入結合有polyT的磁珠加入，再吸出磁珠并且洗脫留下mRNA。
    　　2.瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA是否被裂解。
    　　3.cDNA第一條鏈的合成：使用polyT作為引物，逆轉錄酶催化第一條鏈的合成。
    　　4.cDNA第二條鏈的合成（引物合成法）
    　　4.1.使用末端轉移酶向mRNA-cDNA雜合雙鏈3撇端加入polyC
    　　4.2.NaOH水解mRNA，純化cDNA的第一條鏈
    　　4.3.加入polyG作為引物。合成cDNA的第二條鏈
    　　4.4.純化cDNA，使用單鏈特異性核酸酶對cDNA末端進行處理，形成平末端
    　　5.cDNA同載體連接：選擇使用λ噬菌體載體，使用限制性核酸內切酶對載體和cDNA進行處理，后使用DNA連接酶將二者連接起來。
    　　6.體外包裝并轉化進入受體細胞。
    　　7.藍白斑篩選cDNA文庫。